Decisões do design experimental

Uma série de decisões críticas devem ser tomadas ao projetar um experimento quantitativo de bioimagem. Muitas dessas decisões serão profundamente dependentes do que é possível dada a biologia que você deseja estudar, por exemplo:

• Você sempre preferirá imagens ao vivo à imagens fixas se for importante avaliar a dinâmica de um determinado processo

• Pode ser necessário realizar processos especiais, como clareamento de tecido, se for importante obter imagens profundas em uma amostra relativamente opaca

• Você não pode confiar na marcação genética com proteínas fluorescentes se o seu sistema modelo não for geneticamente permissível para tais manipulações

• Você precisa obter imagens em uma resolução particularmente alta para avaliar com confiança as interações entre duas moléculas fotografadas no mesmo sistema

Portanto, é extremamente importante pensar em todos os aspectos que envolvem sua questão biológica antes de pegar uma pipeta ou lâmina. Muitas decisões de preparação de amostras estão profundamente ligadas à disponibilidade e adequação de microscópios específicos; veja aquela seção para mais informações.

Montagem

Lamínulas de vidro

Muitas aplicações de imagem envolvem a montagem em lamínulas de vidro, diretamente ou usando uma lamínula montada em uma placa. Embora haja uma grande variedade de tamanhos e formatos de lamínulas, o atributo mais importante é a espessura da lamínula. O número da lamínula determina a espessura e a tolerância esperadas. Esses fatores são importantes porque a maioria dos fabricantes de microscópio assume uma espessura de lamínula específica (0,17 mm) no projeto das objetivas para minimizar aberrações. Essas aberrações tendem a afetar o brilho e a resolução axial, reduzindo a relação sinal/ruído, nitidez e resolução. A tolerância da lamínula (para minimizar a variabilidade na espessura) é essencial para técnicas de super-resolução ou medições de intensidade em imagens coletadas com objetivas de alta abertura numérica. Outras aplicações não requerem a montagem de amostras em vidro ou plástico, mas, em vez disso, têm a amostra e a lente objetiva imersas no mesmo meio.

Table 1 Comparação de tipos de lamínulas

Número	Espessura nominal [mm]	Variação de espessura [mm]
#1.5	0,17	0,16 - 0,19
#1.5H	0,17	0,165 - 0,175

Meio de montagem

O índice de refração em que a amostra é colocada, bem como o índice de refração do vidro e o meio entre a objetiva e a amostra são todos críticos para determinar a resolução alcançável. O meio de montagem {term} pode ter outras propriedades ópticas e/ou experimentais importantes; é importante usar o meio de montagem correto para o experimento planejado.

Fig. 3 Efeitos do meio de montagem na coloração com vários fluoróforos. Adaptado de Jonkman J., Brown C.M., Wright G.D et al. Tutorial: orientação para microscopia confocal quantitativa. Nat Prot 15, (2020) ⁵

Seleção do fluoróforo

Os fluoróforos são moléculas que são capazes de emitir luz após a absorção de um fóton, normalmente de comprimento de onda mais curto. Os fluoróforos relevantes para a pesquisa biomédica podem ser corantes orgânicos de pequenas moléculas (FITC, Alexa Fluor 488) que se ligam a estruturas celulares específicas (por exemplo, DAPI, MitoTracker), análogos fluorescentes de pequenas moléculas (por exemplo, faloidina, aminoácidos fluorescentes) ou proteínas fluorescentes. Algumas das propriedades importantes a serem consideradas ao escolher os fluoróforos estão listadas abaixo:

• Espectros de excitação/emissão de cada fluoróforo

• Brilho (os corantes tendem a ser mais brilhantes que as proteínas)

• Fotoestabilidade

• Propensão para oligomerizar (no caso de proteínas fluorescentes)

• Fototoxicidade (ao gerar imagens em amostras vivas)

Compreender os fluoróforos, as especificações do microscópio (fonte de luz, filtros, detector) e os objetivos da análise são fundamentais para selecionar o(s) fluoróforo(s) apropriado(s) para responder uma questão científica. Consulte a seção sobre reprodutibilidade para obter mais informações.