Reprodutibilidade

Uma série de fatores são críticos na concepção de um experimento de microscopia reprodutível. Alguns fatores críticos são apresentados aqui; veja outros trabalhos como ⁹

Validação de anticorpos

Embora em um mundo perfeito, os anticorpos sempre seriam específicos para um alvo específico, infelizmente, isso nem sempre pode ser considerado ao realizar uma imunomarcação. ¹⁰ Quando possível, deve-se realizar controles knockout e/ou knockdown para confirmar a especificidade do anticorpo; quando não for possível, procure outro anticorpo para uma parte diferente da molécula alvo (às vezes chamada de epítopo) e confirme se obteve uma localização consistente.

A otimização das condições de bloqueio e permeabilização para o anticorpo e protocolos específicos podem reduzir o sinal de fundo não específico. Controles sem anticorpos primários devem sempre ser realizados, pois são essenciais para validar a especificidade do sinal.

Validação da localização da proteína fluorescente

A expressão de proteínas marcadas com fluorescência pode possibilitar a localização de uma molécula ou estrutura, especialmente quando não existe nenhum bom anticorpo para imunomarcação e/ou será útil observar o comportamento da molécula em células vivas. Enquanto um estudo comparando a sobreposição entre os mesmos alvos moleculares com proteínas fluorescentes versus anticorpos encontrou 80% de sobreposição, eles também descobriram que algumas considerações (como se o terminal C ou N de uma proteína está marcado) podem causar alterações na localização. ¹¹. Um artigo recente ¹² examina considerações para marcação genética de moléculas para microscopia de amostras vivas.

Vazamento de sinal/contaminação de sinal

Ao realizar microscopia de fluorescência multicolorida, é fundamental escolher fluoróforos com espectros de emissão e excitação suficientemente distintos; ferramentas on-line como FPbase ¹³ podem ajudar com essas seleções, especialmente se você conhece os vários componentes ópticos do microscópio no qual irá gerar imagens de suas amostras (essas configurações podem ser salvas e compartilhadas no FPbase; pergunte ao responsável do microscópio que você planeja usar se tal arquivo de configuração está disponivel online). Mesmo que você acredite que seus fluoróforos estejam suficientemente separados, é fundamental verificar os controles fluorescentes monomarcados usando as mesmas condições de imagem (e de preferência no mesmo dia) que os controles multicoloridos para ter certeza de que não está ocorrendo contaminação dos canais; é obrigatório fazer isso se você planeja medir colocalização.