Colocalização#

O que é colocalização?#

Colocalização é quando dois ou mais marcações (por exemplo, eGFP e mCherry) se sobrepõem espacialmente em sua imagem (também chamado de coocorrência). Outro componente da colocalização é que os marcadores fluorescentes geralmente se correlacionam em intensidade (ou seja, pixels com eGFP mais brilhante também têm mCherry mais brilhante). É muito importante medir quantitativamente a colocalização – não confie apenas em seus olhos!

Também é importante reconhecer que a co-ocorrência não implica necessariamente em interação.

graus de colocalização

Fig. 6 Colocalização é sobre intensidade e sobreposição espacial dos marcadores#


📏 Como faço para medir?

Existem duas formas principais de se olhar para a colocalização: baseada em objeto e baseada em correlação.

  • A colocalização baseada em objetos é apropriada quando você deseja dizer algo sobre uma fração de um objeto que é positiva para outros marcadores (por exemplo, 99% das células eGFP+ também eram mCherry+). Aqui está um exemplo do fluxo de trabalho:

flowchart LR A[Raw image Label #1] -->|Segmentation| B((Identified objects \n eGFP+ cells)) C[Raw image Label #2] --> |Segmentation| D((Identified objects \n mCherry+ cells)) B & D -->E(Measure overlap per cell \n if overlap > threshold %, say colocalized )--> G(Fraction of eGFP+ cells also mCherry+) E --> H(Fraction of mCherry+ cells also eGFP+) classDef empty width:0px,height:0px; style A fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style B fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style C fill:#FFF4d6,stroke:#FFBE0B style C fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A style D fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A

  • A colocalização baseada em correlação é mais apropriada quando os marcadores que você está medindo não são encontrados em objetos discretos ou quando você prevê que o sinal dos marcadores devem ser correlacionados. A colocalização baseada em correlação é mais simples de medir, pois não requer nenhuma segmentação de objetos. Os coeficientes de correlação de Pearson são prontamente mensuráveis na maioria dos softwares de análise de imagem (por exemplo, FIJI, CellProfiler, etc.).

⚠️ Onde as coisas podem dar errado?

  • Não ter controles adequados (por exemplo, controles monomarcados onde apenas um marcador fluorescente está presente). Ruído, iluminação irregular e outros artefatos técnicos podem causar a correlação entre dois canais

  • Não corrigindo a sobreposição entre os canais É comum existir algum grau de sobreposição entre diferentes canais da imagem devido a diferenças na ótica (por exemplo, diferentes cubos de fluorescência). Não corrigir essa mudança (por exemplo, medindo-a e aplicando a correção correspondente aos canais) pode limitar sua capacidade de detectar a colocalização.

  • Bleedthrough ou Contaminação de canais Às vezes, o sinal de um canal fluorescente vaza para outro, o que pode aumentar falsamente a colocalização detectada. Isso acontece com maior frequencia com fluoróforos que possuem espectros semelhantes (por exemplo, GFP e YFP). Isso é causado pelo fluoróforo em um canal sendo fracamente excitado pela luz usada para excitar um fluoróforo diferente e a fluorescência emitida resultante passa pelo filtro de emissão (por exemplo, seus objetos verdes também aparecem no canal amarelo). Avalie isso com controles monomarcados.

  • Interpretação imprópria da medida de colocalização Os detalhes da medida escolhida aqui são muito importantes - elas variam muito em termos de inclusão de pixels de fundo (background), sensibilidade a sinal-ruído, etc. A consulta com um especialista e a inclusão de controles adequados pode ajudá-lo a ter certeza de que sua medição é realmente o que você pensa que é.

📚🤷‍♀️ Onde posso aprender mais?