Considerações para diferentes tipos de amostra#
Existem muitas opções diferentes de tipos de amostras para geração de imagens, e os avanços nas técnicas de preparação de amostras e modalidades de imagem estão continuamente permitindo a geração de imagens de espécimes biológicos mais diversos e complexos. Como em muitos outros aspectos do projeto experimental, a seleção do tipo de amostra vem com lados bons e ruins. As amostras passíveis de preparação simples e geração de imagens tendem a ser pequenas, finas e relativamente transparentes, como uma monocamada de células. Essas amostras têm vantagens óbvias e podem ser visualizadas com alto rendimento, mas podem não ser adequadas para todas as questões biológicas. Às vezes é necessário um espécime mais espesso, como um organoide, ou um tecido inteiro ou seccionado, principalmente quando a questão biológica envolve interações entre diferentes tipos celulares. Considere cuidadosamente qual contexto biológico é apropriado para sua pergunta e quais medições você gostaria de poder fazer. Abaixo, resumimos alguns tipos de amostra comuns
🤔 Quais são minhas opções?
Aqui apresentamos algumas categorias principais de tipos de amostra. Observe que não há limites rígidos entre essas diferentes categorias (por exemplo, células e organoides podem ser cultivados em 3D, muitos desses espécimes podem ser visualizados ao vivo ou após fixação), mas algumas vantagens e desvantagens gerais estão resumidas abaixo.
Células cultivadas
Muitos tipos diferentes de células podem ser cultivados em garrafas ou em uma placa. As células podem ser cultivadas em monocultura, com apenas um tipo de célula, ou em cocultura com vários tipos de células.
Vantagens
Células cultivadas tendem a ser relativamente simples de visualizar e, para muitas questões, podem ser visualizadas com microscopia de campo aberto (consulte [Aquisição](seleção de conteúdo/microscópio)), que é mais rápida e mais acessível do que os métodos confocais ou de superresolução. Além disso, microscópios de alto rendimento integrados à robótica podem permitir a automação de experimentos e aquisição de imagens com células em monocamadas.
As células podem ser congeladas, descongeladas e cultivadas muito mais rapidamente do que trabalhar com espécimes mais complexos, como organoides ou organismos inteiros, diminiuindo a linha do tempo para realizar um experimento
Desvantagens
A maioria das aplicações em microscopia requer imagens através de uma lamínula de vidro de espessura e tolerância específicas. No entanto, muitos tipos de células não sobrevivem ou não podem crescer em vidro e requerem revestimentos adicionais e tratamentos na lamínula para garantir a saúde da amostra. Como alternativa, algumas empresas fabricam câmaras de imagem (placas de poços múltiplos, placas de 35 mm…) com polímeros proprietários que possuem propriedades semelhantes ao vidro (polímeros ópticos), permitindo assim imagens de alta resolução. É imperativo entender se o óleo de imersão usado durante a geração de imagens afeta a integridade desses polímeros, pois os solventes em alguns meios de imersão podem rachar ou dissolver a camada de polímero.
Organoides
Os organoides são células cultivadas em 3D para imitar a estrutura e, às vezes, as funções dos órgãos. Os organoides são normalmente cultivados a partir de células-tronco que se auto-organizam em uma estrutura mais complexa, incluindo a diferenciação em diferentes tipos de células. Os organoides são adequados para responder questões de desenvolvimento, modelagem de doenças e para a compreensão da regeneração de tecidos e órgãos.
Vantagens
Como os organoides contêm vários tipos de células e refletem algumas estruturas e relações celulares observadas em órgãos in vivo, eles são adequados para responder questões mais complexas sobre doenças e interações célula-célula. Eles também podem ser usados para modelar processos e estruturas que são necessariamente 3D e não são bem recpeproduzidas em uma camada plana de células, como muitos processos de desenvolvimento.
Os organoides podem ser produzidos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de amostras humanas ou animais e, portanto, podem modelar processos de doenças específicos de um determinado doador humano.
Desvantagens
Os organoides podem exigir recursos e protocolos mais complexos para cultivo e podem levar mais tempo do que apenas o cultivo de células em monocamas no vidro ou plástico.
Como os organoides são estruturas 3D, eles geralmente não são passíveis de imagem de campo aberto e podem exigir microscopia confocal de varredura por ponto ou spinning disk.
Tecido
Os tecidos são formados quando as células agem juntas para realizar uma função específica. Os tecidos podem ser cultivados tomando um pedaço de um animal ou planta e permitindo que ele continue a sobreviver e crescer em uma placa. Os tecidos também podem ser colhidos de plantas ou animais e corados para diferentes moléculas. Os tecidos são normalmente cortados em pedaços (também conhecidos como tissue section) e podem ser fixados, frescos ou congelados, ou mesmo vivos em imagem ex-vivo.
Vantagens
Os tecidos têm interações célula-célula que são geralmente mais representativas do que acontece in vivo do que na monocamada de cultura celular.
Os repositórios de tecidos humanos doados permitem que a pesquisa biomédica estude uma amostra diversificada de pacientes com uma doença específica.
Desvantagens
Células e tecidos primários tendem a ser mais sensíveis ao ambiente do que linhagens celulares imortalizadas e podem ser mais difíceis de crescer e exigir protocolos especializados, dependendo do tipo de célula.
Os tecidos colhidos de um animal ou planta inteira requerem tempo para o desenvolvimento e crescimento desse espécime antes da coleta.
Organismo inteiro/embrião
Alguns organismos inteiros são finos e transparentes o suficiente para o imageamento. Alguns animais também têm estágios embrionários quase transparentes, como o peixe-zebra (zebrafish). Além disso, imagem intravital é a imagem de estruturas celulares ou processos biológicos dentro de um animal vivo em tempo real, sem extrair os órgãos ou fixar a amostra. Em geral, requer instrumentação específica ou modalidades com melhor penetração de luz, como a microscopia multifotônica e é limitada à capacidade de acessar o órgão específico, muitas vezes através de janelas ópticas.
Vantagens
A imagem de organismos inteiros ou embriões fornece o contexto biológico mais intacto possível ao estudar um processo ou estrutura específica.
Desvantagens
A geração de imagens de espécimes mais espessos pode exigir processamento (clareamento de tecido) da amostra para fazer com que seu índice de refração corresponda ao meio de montagem e reduza a absorção e a dispersão da luz durante o imageamento.
A imagem intravital geralmente requer técnicas cirúrgicas específicas e é supervisionada por comitês de bioética e precisa ser aprovada pelos comitês institucionais.
⚠️ Onde as coisas podem dar errado?
Fotobranqueamento e fototoxicidade - O fotobranqueamento pode ser definido como a destruição irreversível de um fluoróforo em seu estado excitado, ou seja, esse fluoróforo não será mais capaz de emitir luz e, portanto, o sinal de fluorescência se degradará com o tempo, afetando as medidas da razão sinal-ruído medidas e intensidade. Para minimizar o fotobranqueamento durante a aquisição, há vários reagentes que previnem o fotobranqueamento que podem ser adicionados ao meio. Esses agentes minimizam o fotobranqueamento de fluoróforos em diferentes graus e, portanto, é importante entrar em contato com o fabricante para garantir que sejam ideais para o fluoróforo específico. Por exemplo, a adição de removedores de oxigênio ao meio de montage, como glicose oxidase ou piranose 2-oxidase, pode reduzir significativamente o fotobranqueamento. É importante entender que o uso de oxigen scavengers pode afetar a imagem de células vivas, pois essas substâncias podem afetar os níveis de ATP e oxigênio dentro da amostra, comprometendo sua saúde e, portanto, a função biológica.
Células estão morrendo - A luz fluorescente induz dano ao DNA e oxidação de componentes celulares (fototoxicidade). Além disso, o fotobranqueamento de fluoróforo pode induzir ainda mais a fototoxicidade, criando espécies reativas de oxigênio (ERO). A adição de antioxidantes e a remoção de certas moléculas (por exemplo, riboflavina) do meio de montagem pode reduzir as ERO produzidas durante a geração de imagens, melhorando a integridade da amostra.6
Minhas células fixadas não ficaram como o esperado - A fixação pode alterar a localização e a fluorescência de diferentes proteínas. Sempre que possível, compare a distribuição de uma proteína ou molécula de interesse antes e após a fixação. Considere também se um método diferente de fixação pode ser mais apropriado para sua amostra.
Minha amostra é muito opaca - Espécimes mais espessos, como seções de tecido espesso, células pigmentadas ou organismos inteiros podem ser difíceis de obter imagens devido à absorção e dispersão de luz induzidas pela diferença no índice de refração dentro do próprio tecido, resultando em baixa penetração de luz. Para facilitar a geração de imagens de tecidos, os pesquisadores geralmente cortam tecidos grossos em fatias de diferentes espessuras. Este processo é chamado de seccionamento de tecido. Na maioria dos casos, as amostras são fixadas e embebidas em parafina ou congeladas em meio de congelamento de tecidos e posteriormente cortadas em fatias finas por uma máquina como um criostato, micrótomo ou vibratomo e as seções coletadas em um tubo ou lâmina. Alternativamente, como sabemos, a maioria dos componentes em qualquer sistema biológico complexo, como um órgão, não está contida nesse volume bidimensional e, portanto, essa abordagem (seccionamento) compromete a compreensão das relações espaciais entre os componentes celulares. O clareamento do tecido foca-se na redução de pigmentos no tecido, equilibrando o índice de refração {term} em toda a amostra. Isso permite que a luz passe pelo tecido e, portanto, permite imagens volumétricas de alta resolução de órgãos e tecidos inteiros usando técnicas de microscopia convencionais, como microscopia confocal, sem a necessidade de seccionar fisicamente a amostra.