Medidas de intensidade#

O que são medidas de intensidade?#

Intensidade refere-se ao brilho do sinal para um marcador fluorescente. Usando medidas de intensidade, podemos inferir uma quantidade relativa do fluoróforo ou corante. Por exemplo, se você tiver uma proteína marcada com um fluoróforo, poderá medir a intensidade desse fluoróforo para obter uma medida relativa de quanta proteína está presente em sua amostra. As medidas de intensidade são as abaixo (não exaustivo) e podem ser medidas dentro de uma imagem, em um objeto como uma célula ou em sub-regiões de um objeto:

  • Intensidade média: a intensidade média de todos os pixels

  • Intensidade integrada: a soma das intensidades dos pixels, um indicador da quantidade total desse marcador em um objeto

  • Medidas de textura: a suavidade das intensidades


📏 Como faço para medir?

A intensidade é relativamente simples de medir, mas pode ser bastante complicada de se fazer corretamente (veja abaixo). Sugerimos enfaticamente que você entre em contato com um especialista em análise de imagem antes de prosseguir com esse tipo de análise, porque há muitos lugares onde as coisas podem dar errado. Em geral, você deseja medir imagens brutas ou imagens com iluminação corrigida, mas em geral com o mínimo de processamento de imagem. A correção de iluminação é uma forma de processamento de imagem para compensar o padrão irregular de iluminação produzido pela maioria das fontes de luz, onde o meio do campo de iluminação é mais claro que as bordas. Em seguida, as medições de intensidade podem ser feitas em qualquer software de análise de imagem, seja em toda a imagem ou em objetos identificados. Veja abaixo um exemplo de fluxo de trabalho:

flowchart LR A[Raw image] -->|"Correct uneven illumination\n (optional, but best practice)" | B[Corrected image]-->|Segmentation|C((Identified objects \n e.g., cells)) B -->|Measure intensity| E(Image-level intensity \nmeasurements) C -->|Measure intensity| F(Object-level intensity \nmeasurements) classDef empty width:0px,height:0px; style A fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style B fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style C fill:#FFF4d6,stroke:#FFBE0B style C fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A
⚠️ Onde as coisas podem dar errado?

  • Saturação Os pixels saturados são tão brilhantes que seus valores de intensidade atingem o limite máximo do nosso detector (câmera). Se você tiver pixels saturados nas células que está tentando medir, você não poderá fazer a medida correta da intensidade. Isso ocorre porque, para pixels saturados, você não sabe o quão brilhantes eles realmente são, apenas que eles são mais brilhantes do que você pode detectar. Existem algumas medições de intensidade que são insensíveis a alguma saturação. Por exemplo, a intensidade mediana de uma imagem não será afetada pela saturação, a menos que você tenha >½ da imagem saturada. Mas medições como intensidade média serão afetadas pela saturação.

  • Controles inadequados Na maioria dos casos, as medidas exatas de intensidade que você obtém não possuem significado biologico quando isoladas. É apenas por comparação de condições que podemos gerar alguma conclusão biológica. Um controle é, portanto, muito importante para comparar sua condição experimental.

  • Aquisição de imagens em configurações não correspondentes Como as medidas de intensidade são afetadas pelo tempo de exposição, intensidade da fonte de luz e outros fatores, é muito importante combinar as configurações de imagem em suas amostras. Da mesma forma, você deve certificar-se de não separar a aquisição das imagens de suas condições experimentais e do controle em dias diferentes, caso isso puder ser evitado. Os fluoróforos podem tornar-se mais escuros ao longo do tempo, o que complica a interpretação se diferentes tipos de amostra forem imageadas em dias diferentes.

📚🤷‍♀️ Onde posso aprender mais?