Introdução#
Os microscópios são instrumentos ópticos e, como tal, são compostos por diferentes componentes e dispositivos ópticos. Como iniciante, é importante reconhecer os parâmetros experimentais que podem afetar a qualidade e o rigor dos dados de imagem e, por consequência, sua interpretação.
Um conceito fundamental é o “caminho da luz”, que pode ser usado para traçar a trajetória da luz desde a fonte de luz até o detector. Ao trabalhar com microscópios, seja um microscópio de cultura de células ou um sistema de superresolução de ponta, é importante reservar um tempo para traçar os diferentes caminhos de luz no sistema. Abordar o sistema como uma soma de suas partes significa que a otimização e a solução de problemas tornam-se processos sistemáticos em comparação com quando o sistema é tratado como uma caixa preta. Este tutorial interativo em MicroscopyU mostra os caminhos de luz em um microscópio invertido padrão; esta visualização fornece mais detalhes sobre as várias partes.
Tipos de microscópios#
Embora longe de ser uma lista abrangente do que está disponível, alguns dos tipos mais comuns de microscópios estão listados abaixo.
Widefield, às vezes chamados de epifluorescência, são microscópios que absorvem toda a luz disponível em um único caminho de luz; essa abordagem requer o hardware menos complexo e também costuma ser vantajosa ao gerar imagens de amostras com baixo sinal. A Deconvolução às vezes é realizada após a imagem em um microscópio de campo aberto para remover o desfoque.
Confocal - microscópios que removem a luz fora de foco no caminho da luz, geralmente usando um ou mais orifícios para bloquear fisicamente essa luz. Existem várias variantes de microscopia confocal; os microscópios confocais de disco giratório são geralmente preferidos para aplicações de geração de imagens de células vivas, pois tendem a minimizar a toxicidade da amostra.
Os microscópios multifótons utilizam pulsos múltiplos de luz de comprimento de onda mais longo (menor energia) para penetrar profundamente no tecido, uma vez que os tecidos são menos propensos a espalhar esses comprimentos de onda; uma vez lá, vários fótons de baixa energia atingindo o fluoróforo ao mesmo tempo usarão sua energia combinada para ativar um fluoróforo que cada fóton sozinho seria fraco demais para fazer. Como o benefício desses sistemas está em sua penetração mais profunda, eles são frequentemente usados para realizar imagens de animais vivos.
Microscópios de superresolução projetados para permitir que o usuário ultrapasse o limite de resolução óptica (normalmente 200 nm, dependendo da amostra) para resolver estruturas muito pequenas. Às vezes, isso é obtido com hardware especializado (como em STED e SIM) e às vezes com sondas especializadas (como em PALM e STORM).
Microscópios de folha de luz que iluminam a amostra perpendicularmente ao eixo da imagem, geralmente por um segundo conjunto ortogonal de lentes objetivas. Isso permite o seccionamento óptico fino em grandes volumes, mas apresenta mais aspectos sobre a montagem da amostra. Muitas variações em microscópios de folha de luz surgiram nos últimos anos.
Importante
Não importa que tipo de microscópio você use, os microscópios científicos são instrumentos complexos com muitas partes funcionais, todas as quais normalmente devem estar em boas condições de funcionamento e calibradas/alinhadas adequadamente para que a imagem quantitativa ocorra. O responsável do seu microscópio normalmente garantirá isso, mas converse com ele regularmente sobre dúvidas que você possa ter e sobre como as alterações na configuração do microscópio podem afetar sua capacidade de fazer determinadas medições com precisão. O responsável do seu microscópio pode estar mantendo um grande número de microscópios com um grande número de usuários independentes, portanto, se algo parecer «errado», converse com eles antes de prosseguir!