Glossário

Bloqueio

Durante o procedimento de imunocoloração, é importante minimizar a ligação inespecífica dos anticorpos primários ou secundários. Na maioria dos casos, isso é obtido por bloqueio, que normalmente envolve a adição de substâncias como soro normal, gelatina ou albumina antes da imunomarcação para «ocupar» todos os sítios de ligação não específicos na amostra.

Deconvolução

O processo de remover computacionalmente o desfoque das imagens de microscopia usando as propriedades ópticas conhecidas do caminho da luz para «reatribuir» a intensidade do pixel adquirido pela câmera de volta para a estrutura que emitiu a luz.

Imagem ex-vivo

Refere-se à imagem realizada em tecido animal vivo em um ambiente externo controlável (por exemplo, explante de tecido em uma placa de Petri). Ele permite imagens de alta resolução de tecidos vivos que podem ser inacessíveis dentro do animal. O tecido é mantido vivo no sistema de imageamento por meio de perfusão de meios oxigenados (95% de oxigênio e 5% de CO2) com temperatura controlada usando bombas peristálticas e microfluídica.

Fiji

Fiji é apenas o ImageJ. ImageJ2 com muitos plugins.

Fixação

A fixação de uma amostra refere-se à estabilização dos componentes celulares/moleculares dentro da amostra enquanto, ao mesmo tempo, interrompe qualquer função biológica nessa amostra. O fixador usado (por exemplo, paraformaldeído, glutaraldeído, metanol), a concentração e as condições (por exemplo, tampão, temperatura) determinam a qualidade da preservação das estruturas celulares e/ou moleculares dentro de uma amostra e precisam ser otimizados dependendo da amostra ou estrutura que está sendo imageada.

Processamento de imagem

É uma operação que pode ser realizada em uma imagem, resultando em outra imagem. As operações de processamento de imagem podem ser simples (por exemplo, redimensionar ou girar) ou mais avançadas (por exemplo, aprimorar recursos específicos de uma imagem, como círculos ou linhas).

Meio de imersão

O meio de imersão é o meio que preenche o espaço entre a lente objetiva e a lamínula de vidro ou amostra. Ele afeta a abertura numérica da lente objetiva \(NA=RI * sin(θ)\), afetando assim a resolução lateral e axial. É fundamental combinar o IR do meio de imersão com o meio de montagem para minimizar aberrações e melhorar a qualidade da imagem. Os meios de imersão podem ser ar, água, óleo de silicone, glicerol ou óleo.

Imunomarcação

A imunomarcação é uma das técnicas de marcação mais comuns para amostras fixadas. Você pode usar anticorpos primários conjugados a fluoróforos para detectar a proteína de interesse ou uma marcação em duas etapas com um anticorpo primário e um anticorpo secundário conjugado ao fluoróforo. A rotulagem primária-secundária tende a resultar na amplificação do sinal. O principal problema da imunomarcação é o tamanho dos anticorpos, que requerem extensa permeabilização. Outra boa opção é usar nanocorpos, que possuem apenas a cadeia pesada e são significativamente menores que os anticorpos comuns.

Imagem intravital

Refere-se à imagem de estruturas celulares ou processos biológicos dentro de um animal vivo em tempo real, sem extrair os órgãos ou fixar a amostra. Em geral, requer instrumentação específica ou modalidades com melhor penetração de luz, como a microscopia multifotônica e é limitada à capacidade de acessar o órgão específico, muitas vezes através de janelas ópticas. A imagem intravital é supervisionada por comitês de bioética e precisa ser aprovada por comitês institucionais.

Meio de montagem

É a solução na qual sua amostra é colocada (montada). Sua finalidade é preservar a amostra, incluindo os fluoróforos nela contidos, e melhorar a qualidade da imagem durante a aquisição, tamponando o pH, igualando o índice de refração em toda a amostra (idealmente igualando-o ao do vidro) e minimizando o fotobranqueamento (dependendo do meio). O meio de montagem evita que a amostra seque, permitindo o armazenamento a longo prazo.

Detecção de objetos

É a técnica de processamento de imagem para detectar objetos dentro de uma imagem. Não te fornece uma máscara dos objetos, mas pode fornecer uma caixa delimitadora ou a posição x,y.

Removedores de oxigênio

O oxigênio tende a induzir o fotobranqueamento de corantes orgânicos e outros fluoróforos. A adição de removedores de oxigênio ao meio de montagem, como glicose oxidase ou piranose 2-oxidase, pode reduzir significativamente o fotobranqueamento dos fluoróforos presentes na amostra. É importante entender que o uso de removedores de oxigênio pode afetar a imagem de células vivas, pois esses removedores podem afetar os níveis de ATP e oxigênio dentro da amostra, comprometendo sua saúde e, portanto, sua função biológica.

Permeabilização

Para que os anticorpos usados durante a imunomarcação ou outros fluoróforos penetrem e se liguem ao seu antígeno dentro de uma célula ou tecido, a integridade da membrana precisa ser desfeita com um detergente suave. A etapa de permeabilização precisa ser cuidadosamente otimizada dependendo do antígeno de interesse, pois pode resultar em perda de citoplasma ou degradação do sinal.

Índice de refração

É uma medida de como a luz viaja através de um meio específico. É um valor importante ao calcular a abertura numérica de uma objetiva. Idealmente, uma incompatibilidade no índice de refração entre a amostra (meio de montagem), a lamínula e o meio de imersão devem ser minimizadas para melhorar a qualidade da imagem. Veja uma demonstração interativa do índice de refração em MicroscopyU

ROIs

Regiões de Interesse. Pixels em sua imagem que são importantes para você (por exemplo, uma região no tecido, uma célula, um tumor, etc.)

Segmentação

Método de dividir uma imagem em várias partes ou regiões. Existem três tipos diferentes de segmentação.

• A segmentação semântica, onde todas as partes de uma imagem fazem parte de uma classe, comum em biologia celular onde separamos as células do fundo de uma imagem.

• Segmentação por instância, a segmentação é baseada em objetos, não apenas detectando onde as células estão, mas detectando cada célula como um objeto separado.

• Segmentação Panóptica, pode ser definida como uma combinação das duas anteriores, pois identifica o objeto, mas também os classifica. Um exemplo em biologia pode ser detectar todas as células em uma imagem e classificá-las como em divisão ou não.

Limiar

A forma mais fácil de segmentação de imagem, divide a imagem em duas partes o fundo e o primeiro plano (ou sinal). Ele cria uma imagem binária onde normalmente os pixels de fundo seriam alterados para um valor 0 e os valores dos pixels de primeiro plano valeriam 1.

Clareamento de tecido

A geração de imagens de fluorescência compreendendo toda a espessura de um pedaço de tecido é muito desafiadora devido à absorção e dispersão de luz induzidas pelas diferenças nos índices de refração dentro do próprio tecido, resultando em baixa penetração de luz. Além disso, a luz proveniente de diferentes partes da amostra contribuem para o desfoque da fluorescência, reduzindo drasticamente o contraste e a resolução em qualquer plano. Como resultado, os pesquisadores tendem a usar técnicas de seccionamento de tecido para extrair informações sobre componentes celulares e sua distribuição espacial ou a relação de um volume bidimensional fino. No entanto, a maioria dos componentes de qualquer sistema biológico complexo, como um órgão, não está contida nesse volume bidimensional e, portanto, essa abordagem compromete o entendimento das relações espaciais entre os componentes celulares. O clareamento de tecidos reduz diferenças na dispersão de luz no tecido, equilibrando o índice de refração em toda a amostra. Isso permite que a luz passe pelo tecido e, portanto, permite imagens volumétricas de alta resolução de órgãos e tecidos inteiros usando técnicas de microscopia convencionais, como microscopia confocal, sem a necessidade de seccionar fisicamente a amostra.

Seccionamento de tecido

A penetração de luz e a imagem de fluorescência são impactadas negativamente pela dispersão de luz dentro de uma amostra espessa. Essa dispersão se deve aos diferentes índices de refração presentes em um tecido. Para facilitar a geração de imagens de tecidos, os pesquisadores geralmente cortam tecidos grossos em fatias de diferentes espessuras. Este processo é chamado de seccionamento de tecido. Na maioria dos casos, as amostras são fixadas e embebidas em parafina ou congeladas em meio de congelamento de tecidos e posteriormente cortadas em fatias finas por um equipamento como um criostato, micrótomo ou vibratomo e as seções coletadas em um tubo ou lâmina.